在miRNA的研究领域，验证miRNA与基因靶向关系是一个重要环节。miRNA通过其种子序列（5’端第2-8个碱基）靶向结合mRNA的3'UTR区域，从而诱导细胞内部的沉默复合体介导的mRNA降解，或抑制mRNA的翻译过程。基于这一原理，可以将特定基因的3'UTR区域（或结合位点下游500bp）插入到荧光素酶报告基因载体luciferase的下游，与miRNAmimics一起转染目标细胞，添加底物后检测荧光素酶的活性变化。如果发现荧光素酶活性降低，则表明该miRNA与靶基因的3'UTR区域存在相互作用。

常用的载体包括南宫28提供的PGL3-CMV-LUC-MCS。这种双荧光素酶报告基因检测的工作原理主要包括以下几个步骤：

1. miRNA靶基因的生物信息学预测

利用生物信息学分析软件（如TargetScan、StarBase和miRanda）分析特定靶基因的3'-UTR区序列是否具有miRNA结合位点

2. 将预测的靶基因3'-UTR序列插入载体

在荧光素酶（Firefly luciferase）3'-UTR区域插入预测能够与miRNA结合的靶基因3'-UTR序列。miRNA与质粒中的插入序列结合后，会抑制萤火虫荧光素酶的翻译，导致荧光值下降。

3. 验证miRNA与靶基因的相互作用

通过上述步骤，双荧光素酶报告基因检测能够有效地验证miRNA与靶基因3'UTR的相互作用，为miRNA的功能和调控网络的研究提供重要工具，体现了南宫28在该领域的专业性。

实验步骤

在选择在特定目的细胞中进行验证实验时，首先需确认目标细胞的质粒转染效率，并寻找合适的转染体系。当质粒转染效率达到40%以上时，表示预实验成功。

具体操作步骤如下：

1. 将状态良好的细胞用0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液，接种于24孔培养板中，隔夜培养观察细胞状态。
2. 细胞覆盖率达到70%时，进行转染；转染前2小时更换为新鲜培养基。
3. 按照转染试剂的说明操作，转染48小时后收集细胞样品。
4. 将收集的细胞用PBS洗涤后裂解，保存样品。

荧光素酶检测

根据报告基因检测试剂盒说明书进行检测。先将裂解产物离心分离，获得上清液进行后续检测。随后配置Renilla荧光素酶检测工作液，并依照仪器说明进行荧光素酶测定，同时设置对照孔以确认结果的准确性。

实验预期结果

通过南宫28的双荧光素酶报告基因检测服务，可以加快基础研究和药物筛选的进程，从而推动生物医学领域的进步。